Aplicación de las pruebas de PCR convencional simple y múltiple para la identificación de aislamientos de Leptospira spp. en Colombia / Application of conventional and multiplex PCR assays for identification of isolates of Leptospira spp. in Colombia

Debido a las dificultadas asociadas con la identificación serológica de aislamientos de Leptospira ssp, se genera gran interés en la pruebas moleculares por su poder discriminatorio, reproducibilidad y fácil interpretación. Objetivo. Aplicar y validar la prueba de PCR convencional, usando dos pares de iniciadores descritos previamente y dirigidos a los genes lipL32 (PCR simple) y secY/flaB (PCR múltiple), con el fin de evaluar su aplicación para identificar especies patógenas y saprófitas de Leptospira spp. Materiales y métodos. Para la estandarización de las pruebas de PCR se usó 22 cepas de referencia internacional y 12 aislamientos colombianos. Se determinó el nivel de detección de cada pareja de iniciadores, su especificidad frente a otros microorganismos causantes de enfermedades endémicas en Colombia y su capacidad de identificar especies dentro del grupo de Leptospira. Resultados. El límite de detección de la PCR simple lipL32 fue una dilución 1:10000 y para la PCR múltiple secY/flaB fue una dilución 1:100 para el gen secY y 1:1000 para flaB. La especificidad de todos los iniciadores fue de 100 por ciento. La PCR simple lipL32, mostró amplificado específico para 21/22 cepas de referencia mientras que la PCR multiple secY/flaB lo fue para 18/22 cepas. De los 12 aislamientos colombianos, siete fueron positivos por PCR lipL32 y seis lo fueron por PCR secY/flaB. Conclusiones. Los resultados más consistentes fueron obtenidos con la PCR simple lipL32 tanto en límite de detección, especificidad y utilidad para la identificación de Leptospira spp, por lo que esta prueba es aplicable a la identificación molecular de aislamientos patógenos de Leptospira spp de diversas fuentes.

Serological identification of Leptospira ssp isolates is difficult to achieve. Thus, molecular testing may be of great interest thanks to its high discrimination power, reproducibility and easy interpretation. Objective. To implement and validate conventional and multiplex PCR methods (using primers directed against lipl32 and secY/flaB genes, respectively). To assess the capacity of PCR methods to identify pathogenic and saprophytic species of Leptospira ssp. Material and methods. 22 international reference strains and 12 colombian isolates were used. DNA was extracted with a commercial kit (Wizard). Specificity and sensitivity of both PCR methods were evaluated. Results. The maximum dilution of DNA samples allowing the detection of Leptospira ssp was determined to be 1:10000 for the PCR lipL32 and 1:100/1:1000 for the multiplex PCR secY/flaB. Both PCR didn’t detect DNA from microorganisms unrelated to Leptospira ssp. The lipL32 PCR specifically amplified a 423bp fragment from all pathogenic Leptospira reference strains, while the secY/flaB PCR amplified both 285bp (secY) and 793bp (flaB) fragments from 18 reference strains. The lipL32 PCR detected 7/12 colombian isolates, while secY/flaB PCR detected both secY and flaB genes from 6/12 isolates. Conclusions. Best results were obtained with the lipL32 PCR, which displayed a better sensitivity and a better capacity to detect different strains than the multiplex PCR. The secY primers showed a poor specificity to pathogenic species and a poor sensitivity. Thus, lipL32 primers show high potential for molecular diagnosis of Leptospira spp in clinical and environmental samples.

Diagnóstico de leptospirosis de muestras de sangre y cultivo por observación en microscopio de campo oscuro / Diagnosis of leptospirosis by dark-field microscopy of blood samples and culture

La leptospirosis, una de las zoonosis más extendidas en el mundo, es considerada una enfermedad reemergente, producida por especies patógenas del género Leptospira que comprende, aproximadamente, 13 de las 17 especies descritas hasta el momento; éstas son indistinguibles morfológicamente y su clasificación taxonómica se hace por métodos moleculares. La leptospirosis se presenta con múltiples síntomas inespecíficos y para llegar a la definición de caso confirmado, el personal médico debe, además de reconocer las manifestaciones clínicas que coinciden con leptospirosis, confirmar la sospecha diagnóstica de la enfermedad por laboratorio, bien sea por: 1) observación al microscopio de campo oscuro de la bacteria en muestras de sangre u orina, o en tejidos obtenidos post mórtem y, en este caso, se usan coloraciones especiales de plata o inmunofluorescencia; 2) cultivo positivo (sangre, orina, líquido cefalorraquídeo o muestras post mórtem); 3) incremento o alza cuádruple de los títulos por microaglutinación en sueros pareados tomados con un intervalo de 15 días; 4) título alto único (>1:400) utilizando diagnóstico serológico por microaglutinación o pruebas que detecten IgM, o 5) resultado positivo de la prueba de reacción en cadena de la polimerasa en sangre, orina, líquido cefalorraquídeo o muestras de tejidos post mórtem.Debido a que las dos primeras formas de diagnóstico requieren de un personal experto para la visualización de Leptospira spp., nos proponemos presentar a la comunidad médica imágenes de referencia de Leptospira spp. que se observan en el microscopio de campo oscuro provenientes de muestras de sangre o de cultivo.Se necesita disponer de métodos de diagnóstico para leptospirosis en los laboratorios de salud pública, además de personal capacitado para realizarlos, lo cual permite confirmar el diagnóstico clínico de una etiología que como ésta, presenta síntomas comunes a otras enfermedades endémicas en Colombia, como son el dengue y el paludismo.